SilencerDB沉默子元件数据的来源

首先从物种来看，主要包括人类和小鼠的数据资源。

从组织器官覆盖度来看，Silencer数据也是覆盖比较全面的。

从数据来源的方法来看，可以看到绝大部分数据来源于计算方法预测，只有非常少的部分数据来源于高通量或低通量的实验验证。值得注意的是，其中实验验证的Silencer元件基本来源于Blood样本。

这篇文章里，我主要介绍SilencerDB数据库建立涉及到的计算方法的原理。

一、使用H3K27me3-DHS活性和基因表达的关联来预测Silencer
H3K27me3-DHS指与H3K27me3 peaks重叠的染色质开放区域，其活性和开放染色质的覆盖深度相关。该研究采用的是至少在三个细胞系中出现的H3K27me3-DHS peaks。该方法从两个方面来关联H3K27me3-DHS活性和基因表达：一是H3K27me3-DHS和邻近基因表达的相关性分析，二是H3K27me3-DHS和Hi-C远程作用的基因表达的相关性分析。

$corr(G,h) = sign(avg(G_{h=1})-avg(G_{h=0}))*p(G_{h=1},G_{h=0})$

$h=1$，代表该区域H3K27me3-DHS存在；$h=0$代表该区域H3K27me3-DHS不存在。
$p(G_{h=1},G_{h=0})$表示该区域H3K27me3-DHS存在和不存在时，对应基因表达的差异显著性（Wilcoxon秩和检验P-value）
$sign(avg(G_{h=1})-avg(G_{h=0}))$是一个示性函数，描述了该区域H3K27me3-DHS存在和不存在之间，对应平均基因表达水平的差异，示性为正相关，负相关或者不相关。
$−0.05 < corr(G,h) < 0$，该H3K27me3-DHS和对应基因表达显著负相关；
$0 < corr(G,h) < 0.05$，该H3K27me3-DHS和对应基因表达显著正相关；
其余情况，该H3K27me3-DHS和对应基因表达无显著相关。

该研究也通过eQTL基因和转录抑制因子的富集，验证了correlation预测的silencer集合。

基于MPRA(大规模平行报告分析)验证关联分析预测的silencer集合

该实验选用了10个negCOR silencers（S1…S10）和4个基因表达无显著相关的H3K27me3-DHS（H1…H4），用K562细胞（an enhancer + SV40 promoter + luciferase reporter gene）作为基因报告实验体。结果如图所示，14条测试序列都表现出显著抑制基因表达的效果，即使是先前与基因表达无显著关联的H3K27me3-DHS区域。这个实验的不足还是实验过少，而预测的结果太多。

二、基于SVM的沉默效应分类器
上文H3K27me3-DHS活性和对应基因表达的关联性分析，确定了一些H3K27me3-DHS的调控属性，和基因表达正相关的类增强子元件，和基因表达负相关的类沉默子元件，以及无调控属性的区域。
正集：negtive correlation H3K27me3-DHS；负集：positive correlation H3K27me3-DHS；
H3K27me3-DHS用该区域的putative TFBSs，组蛋白修饰信号密度，邻近基因表达水平的最大值和最小值编码。
模型：linear kernel SVM；least squares; fivefold cross-validation.
应用以上基于negtive correlation H3K27me3-DHS和positive correlation H3K27me3-DHS构建的线性SVM模型，对所有训练样本的分类进行校正；并用构建好的模型对其余H3K27me3-DHS区域进行分类评分，划定阈值，和negtive correlation H3K27me3-DHS相似的区域划分为Silencer。控制FDR <= 0.1。

图A为不同组织类型中silencer预测AUC值，范围0.62到0.89；ROC值范围0.71到0.82；图B为K562细胞中的AUC和ROC曲线。

该研究根据Hi-C连接情况，将SVM silencer关联的基因分为两组：“distal SVM gene”，这类基因仅有一个SVM silencer存在Hi-C连接，并且该SVM silencer被一个及以上的基因给分隔开；另一类为“proximal SVM gene”，这类基因由至少一个SVM silencer通过Hi-C产生连接，并且这些SVM silencer位于基因内部（内含子区）。个人觉得这里很奇怪，关联的基因应该还有其它类型，比如多个远端silencer Hi-C连接的gene。
因为之前构建SVM模型的时候，采用了邻近基因的表达水平作为特征，所以这里可以用Hi-C连接的远端基因的表达水平来验证SVM预测的silencer。如图C所示，通过Hi-C连接的“proximal SVM gene”和“distal SVM gene”的基因表达水平都显著低于背景水平和H3K27me3-DHS整体水平。约有65%的SVM silencer相关的远端基因的表达水平显著低于随机期望（65% of distal SVM genes versus 50% of all genes, binomial test P < 10−100）。同样，针对eQTL关联的基因去验证，可以发现SVM silencer关联基因的显著低水平表达（图D）。

同样，针对SVM预测的silencer，研究也通过转录抑制因子和除H3K27me3以外的其它抑制型组蛋白修饰信号的富集，来验证。

三、基于gkm-SVM的沉默效应分类器

1. 采用simple subtractive analysis方法定义uncharacterized CREs
   
   将不同细胞类型基因组DHS染色质开放区，除去已知promoter（2.5 kb window around TSS and H3K4me3 peaks），enhancer（H3K4me1 peaks）或者insulator CTCFBS（CTCF sites）区域，剩下的这部分未知区域，定义为uncharacterized CREs。该研究从Roadmap和ENCODE数据库中总共获得了82个人类细胞类型中2,315,105 uncharacterized CREs，22个小鼠细胞类型中1,299,866 uncharacterized CREs，用于silencer元件的鉴定和预测。
2. 对uncharacterized CREs进行抑制型转录因子motif和抑制型转录因子结合位点富集分析，发现该区域存在显著富集
3. MPRA实验验证部分uncharacterized CREs
   
   实验设计：k562细胞； 基于STARR-seq的MPRA；super core promoter (SCP1)；7430 uncharacterized CREs（其中3705个至少含有一个已知抑制型TFBS，另外3725个至少含有一个抑制型转录因子motif）, 20 known silencer elements, 20 known enhancer elements, and 67 randomly selected regions（control sets）
   总共在7430 uncharacterized CREs找到活性水平低于随机控制组的uncharacterized CREs3001个，定义为沉默子（silencer ）。
   随后该研究也从传统的基因报告实验（SCP1+luciferase gene；K562细胞），和CRISPR-Cas9基因编辑实验（敲除uncharacterized CREs，评估对基因表达的影响）对潜在silencer进行了验证，结果发现这些uncharacterized CREs基本属于沉默元件。
4. 潜在沉默子元件预测
   
   正集：the top 2000 uncharacterized CREs sequences with the lowest MPRA activity (K562 cells)
   负集：the bottom 2000 uncharacterized CREs sequences with highest MPRA activity (K562 cells)
   模型：gkm-SVM：80%（trainning），20%（test）
   选择准确度最高的模型用于silencer预测。
   该研究也提取了对数据有区分度的特征集，发现这部分特征集富集抑制型转录因子motif。
   该研究在人类82个细胞组织类型中总共预测了1,706,989 candidate silencer elements，在小鼠22个细胞组织类型中预测了965,198 candidate silencer elements。

四、基于深度学习模型的框架

注意事项：
基于SVM silencer预测的方法使用的训练数据集来源于correlation分析的结果，因此correlation分析会比SVM预测的结果更可靠，correlation分析的准确性也会影响SVM预测的准确性。

References：

1. http://health.tsinghua.edu.cn/silencerdb/download.php
2. Huang D, Petrykowska HM, Miller BF, Elnitski L, Ovcharenko I. Identification of human silencers by correlating cross-tissue epigenetic profiles and gene expression. Genome Res. 2019;29(4):657-667.
3. Doni Jayavelu, N., Jajodia, A., Mishra, A. et al. Candidate silencer elements for the human and mouse genomes. Nat Commun 11, 1061 (2020).